第三节　人乳头状瘤病毒与口咽癌

一、流行病学

人乳头状瘤病毒（HPV）是乳头状瘤病毒属、小型环状闭合双链DNA病毒。由DNA核酸和衣壳蛋白组成，基因组长度约7 900bp，由72个壳粒组成正二十面体衣壳，无包膜，直径45～55nm。HPV-DNA基因组根据功能分为3个区域：早期区（E）、晚期区（L）以及上游调控区域（upstream regulatory region，URR）。早期序列包括E1、E2、E4～E7亚区，部分类型包括E3和E8，与病毒的复制及致癌作用相关。晚期序列包括L1/L2，主要编码L1及L2病毒衣壳蛋白，参与病毒基因组的包装和病毒释放。非编码区即上游调控区，URR长度约400～1 000bp，位于E区与L区之间，该序列包含p97核心启动子及其他通过控制开放阅读区转录，进而调控病毒DNA复制的增强子及沉默子，是病毒基因组中变异度最高的部分，对病毒和宿主细胞基因转录起重要作用。图2-3-1以HPV-16型为例，概述了每个序列的主要功能。

HPV主要通过接触感染部位或污染的物品进行传播，如口交等性行为、生活中密切接触或母婴传播等途径。HPV具有高度的嗜组织性，可特异性侵犯人类皮肤和黏膜组织中的基底角质形成细胞。1983年，Syrjänen等首次描述了HPV感染与头颈部鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）之间的相关性。后来，德国科学家哈拉尔德·楚尔·豪森（Harald zur Hausen）因明确了HPV感染引发宫颈癌而于2008年获诺贝尔医学奖。在过去的几十年里，从流行病学、临床病理及生物分子研究中积累的证据已表明，发生于口腔、口咽、下咽及喉部等多种部位的HNSCC中存在HPV感染，HPV是影响HNSCC发生发展的重要危险因素之一。大多数HPV相关性HNSCC发生于口咽部，尤其好发于舌根及扁桃体，特别是那些发源于扁桃体隐窝上皮的口咽癌，显示具有最高的HPV可归因部分。HPV相关性口咽癌占所有口咽癌病例总数的25%～30%，然而只有小部分口腔癌是由HPV所引发（3%）。

至今已鉴定出100多种HPV亚型，根据其驱动恶性转化的能力，将其分为高危型与低危型。目前，在口咽癌中发现的亚型主要有 HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59等高危型以及 HPV6、HPV11、HPV32、HPV44、HPV53、HPV57、HPV81等低危型的存在。HPV16、HPV18是引发口咽癌最常见的HPV亚型，其中HPV阳性口咽癌中HPV16高危基因型占绝大多数（90%～95%），HPV18次之（约3%）。高危基因型HPV DNA的流行率因地理区域而异。对于口咽癌，北美地区高危型HPV流行率最高（约60%），亚洲、大洋洲和欧洲地区流行率中等（约36%～45%），南美洲和中美洲流行率较低（约15%）。不同的是，对于口腔癌，高危型HPV DNA流行率在亚洲地区最高（HPV16型约占25%）。

近年来，由吸烟、饮酒导致的口咽癌比例逐年下降，而HPV相关性口咽癌比例急剧上升，其上升趋势在西方国家尤为显著。全球每年约有38 000例新发口咽癌病例，其中HPV相关性口咽癌约29 000例，且在北美、欧洲、澳大利亚、新西兰和日本等发达国家和地区发病率较高。在世界范围内，口咽癌中HPV可归因比例从1990—1994年的7.2%上升至2010—2012年的32.7%。在美国，20世纪80年代初期，HPV感染约占口咽癌病例的16%，而最近的研究表明其占据比例已大于60%。与北美地区相比，欧洲地区HPV阳性口咽癌比例急剧上升，速度也更快。2000年以前两者间患病率存在的显著差距已消失，且欧洲地区口咽癌HPV可归因比例略大于北美地区（分别为73.1%、69.7%）。瑞典斯德哥尔摩的一项回顾性队列研究指出，使用相同的检测手段所确定的口咽癌中HPV阳性病例占据比例在1970—2007年由23.3%上升至93%。我国的学者也对中国各地区口咽癌患者HPV可归因比例进行了探究，各地区口咽癌HPV检出率在5%～50%不等。Guo等人基于中国人群HPV16感染率与HNSCC相关性的Meta分析研究显示，我国HNSCC病例中HPV16感染病例占比约为24.7%，其中口咽癌病例HPV16可归因比例约为31.6%。

HPV阳性口咽癌发病率逐年上升趋势被认为可能与人们性习惯的改变相关。Gillison等人及Dahlstrom等人发现HPV阳性口咽癌与早期性行为，以及终身性伴侣或口交性伴侣数量的增加密切相关。不同地区HPV阳性口咽癌患病率的差异可能与各地区性习惯和性开放程度不同有关。此外，HPV阳性口咽癌患者的临床病理特征与HPV阴性口咽癌有所不同，这两种类型均好发于男性，但是HPV阳性肿瘤的患病率在较为年轻（中年，如54～58岁）以及社会经济地位较高的白人中较高，且HPV阳性口咽癌常伴颈部淋巴结转移。在白人中，每10万人中约有1.8名女性和9.4名男性被诊断出患有与HPV相关的口咽癌。此外，与HPV阴性口咽癌相比，HPV阳性病例更好发于吸食大麻的个体，而过量吸烟及酗酒个体患病率较低。然而，最近的各项研究表明，47%～71%的HPV阳性口咽癌患者具有吸烟史。此外，61%～75%的HPV阳性口咽癌患者具有饮酒史。因此，需要更多的研究来明确口咽癌风险因素HPV、烟草和酒精之间的相互作用。

目前，尚不完全清楚为什么HPV相关性HNSCC好发于口咽部。实际上，在HPV相关性口咽癌最常发生位点的扁桃体非恶性组织样本相关研究中，部分研究未能检测到HPV的存在，部分研究则仅发现相当低的HPV感染率。传统上，研究人员认为HPV感染是由于微创伤后基底上皮细胞暴露于病毒而造成的。口咽部的组织结构类似于子宫颈和肛门部位，表现为鳞状柱状上皮移行带。因此，移行区内化生基底/储备细胞（metaplastic basal/ reserve cells）的可达性可以解释这些部位对致癌性HPV的易感性。另一种观点则认为口咽癌特异倾向发生于舌根及扁桃体部位可能与以下情况有关：①扁桃体隐窝的深入凹陷性结构可能作为HPV和其他病原体的天然储藏区；②这些部位组织学表现为网状的上皮细胞层（reticulated epithelium）及不连续的基底膜使其屏障作用减弱，HPV更易侵入；③此淋巴组织深层陷窝结构代表免疫豁免部位（immune-privileged sites），即有利于HPV持续性感染并允许肿瘤逃避免疫监视。

二、致病机制

HPV病毒不能编码DNA聚合酶，故HPV基因组以游离状态存在。机体受高危型HPV持续感染，免疫系统无法完全清除HPV病毒，以致HPV病毒将自身DNA整合到宿主细胞基因组中，遗传或表观遗传改变的积累和HPV的整合是癌变转化和肿瘤进展中的重要事件。HNSCC的全基因组序列研究显示，HPV整合通过促进致癌基因的表达、破坏肿瘤抑制基因以及驱动染色体间/内重排影响宿主基因组。此外，HPV整合及未整合到宿主细胞基因组时，肿瘤组织的相应基因表达谱和DNA甲基化模式具有差异。HPV整合可能在宿主细胞基因组不稳定性中发挥作用，从而影响HPV相关性口咽癌的预后。Vojtechova等人及Lim等人的研究报道，HPV相关性口咽癌中HPV基因组DNA主要表现为整合型或者游离型和整合型共存，这两类患者间的生存率无显著差异。因此，在综合技术评价研究取得进展的基础上，尚需进一步研究以明确HPV基因组整合对口咽癌患者预后的影响。

支持HPV驱动口咽癌发生的分子生物学证据如下：①90%的HPV阳性口咽癌病例为高危型、致瘤性HPV16型感染；②原位杂交实验表明HPV16定位于肿瘤细胞核；③HPV阳性肿瘤细胞核中HPV16 DNA具有高拷贝数；④HPV16基因组DNA经常被整合到HPV阳性肿瘤细胞中，且其主要病毒致癌性mRNA E6和E7具有转录活性。此外，分子遗传谱的差异支持HPV相关性口咽癌与烟草和酒精相关性口咽癌在分子生物学特征上的不同。HPV阴性口咽癌发生的早期阶段，可检测到染色体9p、3p和17p存在基因缺失，特别是分别位于17p13和9p21区域的肿瘤抑制基因肿瘤蛋白53（tumor protein 53，TP53）（编码p53蛋白）和细胞周期依赖性激酶抑制剂2A（cyclin-dependent kinase inhibitor 2A，CDKN2A）（编码p16蛋白）的缺失。因此，频繁的p53和p16突变导致细胞周期调节异常和基因组失稳。相比之下，HPV相关性口咽癌往往缺乏这类染色体基因的缺失，而表现为野生型p53表达减少以及p16上调。

尽管HPV病毒致癌的分子机制并未最终明确，但现有研究支持病毒E6和E7蛋白在致癌过程中发挥重要作用。HPV有3个基因功能区：早期区、晚期区和上游调控区，其中早期区编码早期蛋白E1、E2、E4、E5、E6和E7，参与调节病毒的生命周期、调控DNA复制、转录和病毒蛋白的翻译等。HPV病毒致癌蛋白E6和E7分别约有160及100个氨基酸，可以通过其特异的结构与其他抑癌因子竞争性结合使其抑癌作用失活，因此E6和E7的持续表达是促进及维持口咽癌发生发展所必需的。E6蛋白可以通过其锌指结构与泛素连接酶形成复合物泛素蛋白酶E6-AP，促进p53泛素化和蛋白酶体降解，致其失活，但是p53的mRNA水平并无明显改变。E6蛋白可结合p53蛋白的C端，阻止p53进入细胞核，使其无法发挥抑癌基因的作用，从而引起宿主细胞增殖过程中基因组失稳和DNA突变累积，最终抑制p53依赖性细胞周期阻滞，促使细胞从细胞周期G1期向S期转化，促进细胞异常分裂增殖，抑制细胞凋亡，使细胞永生化。此外，E6还可激活细胞端粒酶活性，使细胞端粒长度不随细胞分裂增殖而缩短，使细胞实现无限增殖而发生恶性转化。E7蛋白可结合低磷酸化状态的视网膜母细胞瘤蛋白（retinoblastoma protein，pRb），致其功能丧失导致E2F释放，促进细胞S期DNA合成，从而促进细胞周期进展和恶性转化，并支持病毒的复制。pRb功能失活导致p16^INK4a蛋白表达代偿性增加，使上皮细胞逃脱致癌基因诱导的衰老，并激活其生存信号通路。在HPV相关肿瘤中，p16^INK4a过表达对细胞存活至关重要。而在HPV非相关肿瘤中，它经常失活，这使得p16^INK4a过表达成为口咽癌发生中HPV具有转录活性的间接标记物。对于低危型HPV，其E6蛋白并不影响宿主细胞p53蛋白的稳定性，且其E7蛋白与pRb的结合效率较低。E5蛋白不一定表达，但当它表达时则可对表皮生长因子受体（EGFR）、免疫识别和凋亡调节等多种信号通路产生影响。其他早期区蛋白（E1、E2和E4）对完成病毒复制周期至关重要，但它们的活性在促进癌变中并不重要。图2-3-2总结了高危型HPV主要的致癌分子机制。

三、人乳头状瘤病毒疫苗

由于HPV相关性口咽癌好发于扁桃体组织深部隐窝上皮，病灶隐蔽，难以通过早期筛查进行干预，因此为人群接种HPV疫苗预防感染进而防止肿瘤的发生显得尤为重要。目前市场上有三种HPV疫苗用于预防感染，主要针对未感染人群，对已感染者无治疗效果。2006年，第一种针对高危亚型HPV16、HPV18及低危亚型HPV6、HPV11的四价疫苗（Gardasil）获得了FDA的批准，第二种针对HPV16、HPV18的二价疫苗（Cervarix）于2007年得到验证。2014年，九价HPV疫苗（Gardasil 9）（抗HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV45、HPV52、HPV58、HPV6和HPV11）在美国获批上市，并在2018年4月28日获中国国家药品监督管理局批准于我国上市。2009年，世界卫生组织建议对9～13岁女性进行常规HPV疫苗接种，2011年，建议接种年龄范围扩展至26岁。2018年，FDA批准Gardasil九价HPV疫苗接种年龄范围扩大至45岁以下的男性及女性。目前，对女孩接种HPV疫苗正在进行中，有82个国家实施了针对女孩的国家性HPV免疫计划，但是全球年轻女性的HPV疫苗接种率仍然很低，截至2017年全球9～45岁女性的HPV疫苗接种率仅为2%，且大多数国家尚未开始为男孩接种HPV疫苗，仅有约13个国家实施了对男孩的HPV疫苗接种计划。HPV疫苗预防宫颈癌及其他相关的肛门-生殖器癌方面的有效性已被广泛研究及证明，然而其用于预防口腔及口咽部HPV感染的有效性尚未被充分评估。Pinto等人的研究显示，男性接种Gardasil四价疫苗可在口腔唾液样本中检测到HPV16及HPV18型IgG，且抗体表达水平与循环血液中的表达水平相关。Hirth等人的研究表明，年轻人（18～30岁）接种HPV疫苗（HPV6、HPV11、HPV16、HPV18型）后，与未接种的年轻人相比，其口腔具有较低的疫苗特异型HPV感染率，HPV疫苗接种似乎为一般人群中的男性和女性提供了特异型HPV感染的防护。预防性HPV疫苗接种可将口腔HPV感染的患病率降低88%～93%。考虑到HPV感染发病潜伏期长以及疫苗接种率低，预计接种HPV疫苗有望在2060年降低口咽癌的发病率，而当前HPV相关性口咽癌的发病率并不会立即改变。

（陶小安　程斌）